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Techniken der Molekularbiologie

Techniken der Molekularbiologie

DNA-Analyse

Gewinnung von DNA

Um an die Erbinformation (DNA) des Zellkerns zu gelangen, werden zunächst die Zellwände zerstört. Dies erfolgt durch Mörsern oder vergleichbare Techniken. Das dabei entstehende Gemenge von Zellbruchstücken enthält die DNA nur in sehr unreiner Form. DNA ist wasserlöslich und kann daher mittels eines Puffers (Lösung mit bestimmtem Salzgehalt) von den unlöslichen Bestandteilen getrennt werden. Es schließen sich Aufreinigungsschritte an, durch die z.B. Proteine entfernt werden. Übrig bleibt ein gelartiger Tropfen, der DNA und Wasser enthält.

* DNA Extraktion mit Küchenmitteln

Agarose-Gelelektrophorese

Um DNA oder RNA (die Abschriftform der DNA) zu untersuchen ist es häufig nötig sie der Größe nach zu sortieren. Dies geschieht mittels der Gelelektrophorese: Unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes lässt man die zu trennenden Moleküle durch ein Gel laufen, das in einer ionischen Pufferlösung liegt. Das Gel wirkt wie ein Molekularsieb - je kleiner die Moleküle um so schneller wandern sie durch dieses Sieb – negativ geladene Moleküle (Anionen) zur postiv geladenen Anode, positiv geladene Moleküle (Kationen) zur negativ geladenen Kathode. Als Gel wird polymerisierte Agarose verwendet, die aus einer Alge gewonnen wird. Der Schmelzpunkt liegt im Unterschied zur Gelatine höher, bei 65°C, was ein Arbeiten bei Zimmertemperatur ermöglicht.

PCR

Die Polymerase Kettenreaktion (vom englischen Polymerase Chain Reaktion) ist eine Technik zur Vervielfältigung spezifischer DNA Sequenzen. DNA liegt normalerweise doppelsträngig vor und wird zu Beginn des Prozesses durch Erhitzen (95°C) in Einzelstränge getrennt. Am Anfang und am Ende des spezifischen Abschnitts werden Oligonukleotide, sog. Primer gesetzt, die das passende Muster der DNA besitzen und sich nur an die entsprechende DNA-Stelle binden können. Zu dem dazwischen liegenden DNA Abschnitt wird mit Hilfe eines temperatur-unempfindlichen Enzyms (DNA-Polymerase) der jeweils gegengleiche (komplementäre) DNA Strang aufgebaut. Der derart gebildete Doppelstrang wird durch Erhöhung der Temperatur wieder getrennt. Damit sind die Bindungsstellen für die Primer erneut frei und der Vorgang kann nach dem Absinken der Temperatur von Neuem starten. Die Vermehrung erfolgt exponentiell. Mit dieser Methode ist es möglich bereits 1 DNA Molekül millionenfach zu vervielfältigen und dadurch nachzuweisen.

* Komm ins Beet Poster zur PCR (500 kb)

Oft sucht man auf der DNA bestimmte Sequenzen (Basenfolgen). Um diese zu finden, benutzt man die Technik der radioaktiven Markierung. In der PCR ist es möglich radioaktives Phosphat in Marker bekannter Sequenz einbauen zu lassen. Diese Marker werden dann als Komplementärstrang an die zu untersuchende DNA angelagert. Durch Auflegen eines Films wird die Position der radioaktiven Markierung und damit der gesuchten DNA-Sequenz sichtbar (Autoradiographie).

Southern Blotting

Southern Blotting besteht aus der Auftrennung von DNA mittels Gelelektrophorese und der anschließenden radioaktiven Markierung von gesuchten Sequenzen. Zu diesem Zweck wird die von Restriktionsenzymen geschnittene DNA, die mittels Agarose- Gelelektrophorese ihrer Größe nach aufgetrennt wurde auf ein Nitrocellulosemembran überführt. Dies geschieht über Kapillarkräfte, die einen Flüssigkeitsstrom aus dem Gel in die Membran leiten und so die DNA in die Membran transportieren. An diese Membran gebunden, kann die DNA nun mittels Autoradiographie sequenzspezifisch untersucht werden. Man erhält so Aussagen darüber, ob und wo eine gesuchte Sequenz vorhanden ist.

Restriktionsenzyme

Im Kampf gegen schädliche Viren haben Zellen molekulare Scheren entwickelt, Komm Ins Beetdie der Zerstörung eingedrungener DNA dienen. Diese Restriktionsenzyme genannten Scheren sind in der Lage DNA an spezifischen Stellen zu durchtrennen. Heute werden diese Enzyme auch außerhalb von Zellen, im Labor eingesetzt. Die Schnitte werden immer in bestimmten, für das jeweilige Enzym typische, Basenfolgen gesetzt. Man unterscheidet dabei Enzyme, die überhängende Enden stehen lassen, und solche, die gerade Enden schneiden. Die dabei entstehenden Enden können sich mit anderen Enden verbinden, sofern diese die komplementäre Basensequenz beinhalten. Verdaut man mittels dieser Enzyme DNA z.B. aus dem Kern, entstehen zahlreiche Bruchstücke sogenannte Restriktionsfragmente. Häufig werden in der Molekularbiologie auch ringförmige DNA-Moleküle sogenannte Plasmide geschnitten. Wird ein Plasmid nur einmal geschnitten, erhält man ein Fragment, schneidet man zweimal, so erhält man zwei Fragmente etc. Die Anzahl der Schnitte leitet sich dabei aus der Basensequenz des Plasmids und dem eingesetzten Enzym ab. Die entstehenden Fragmente können mittels Agarose- Gelelektrophorese der Größe nach getrennt werden.

Plasmid DNA Analyse

Plasmide sind ringförmige DNA Moleküle, die zusätzlich zur Kern-DNA in Bakterien vorkommen. Sie enthalten häufig Informationen über Resistenzen oder andere Fähigkeiten. Der Vorteil für die Bakterien liegt darin, dass die Plasmide nicht nur an die eigenen Nachkommen weitergegeben werden können, sondern auch an in der Nähe befindliche andere Bakterien oder wie beim Agrobacterium tumefascients an Pflanzen. Plasmide finden in der modernen Molekularbiologie häufig Verwendung als Träger für fremde DNA.

RNA Analyse

Die Aufgabe der RNA besteht darin, die genetische Information der DNA zu kopieren (Translation) und sie an den Ribosomen der Zelle in Proteine zu übersetzen (Translation). Zur RNA-Analyse verwendet man das Northern Blotting. Es funktioniert wie das Southern Blotting, nur, dass es sich um RNA und nicht um DNA handelt, die mit komplementären, radioaktiv markierten Sonden untersucht wird. Das Gel enthält zusätzlich noch Chemikalien, die eine Zersetzung der sehr empfindlichen RNA verhindern.

Techniken zur Analyse von Ablesevorgängen auf der Basis des gesamten Genoms

In letzter Zeit werden immer mehr Organismen als „vollständig durchsequenziert“ bezeichnet. Das bedeutet, das die Basenfolge aller ihrer Gene und die Anordnung der Gene auf den Chromosomen bekannt ist. Dies gilt für den Menschen und für weitere sogenannte Modellorganismen wie Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana), Reis (oryza sativa), Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) oder Fruchtfliege (Drosophila melanogaster). Da alle Gene von ihrer Basenfolge her bekannt sind, ist es möglich jedes Gen im Rahmen einer PCR zu vervielfältigen. Durch die zunehmende Miniaturisierung ist es möglich bis zu 30.000 Gene in einem einzigen Experiment zu vermessen. Hierzu wird die Häufigkeit der mRNA (instabile Abschriften der DNA zur Produktion von Proteinen) bestimmt.

Die Primer für die PCR sind in diesen Experimenten auf der Oberfläche eines „Chips“ befestigt, so dass die Reaktionen „ortsspezifisch“ auf der Trägerplatte ablaufen und dort mittels eines Farbstoffes (oder radioaktiv) sichtbar gemacht werden können. Ein solcher Chip hat ungefähr die Größe eines Objektträgers in der Mikroskopie. Die Primerpaare werden dementsprechend von Robotern aufgebracht, da die für dieses Verfahren nötige Präzision von Menschen nicht aufgebracht werden kann. Die Auswertung einer bei diesen Experimenten entstehenden „Momentaufnahme“ des Expressionsgeschehens in einer Zelle, erfordert komplizierte computergestützte statistische Verfahren, deren Entwicklung in den Bereich der Bioinformatik fällt.

Techniken zur Analyse von Stoffwechselprodukten

Die Techniken zur Analyse von Stoffwechselprodukten sind vielfältig und ständig werden neue entwickelt bzw. alte Techniken verbessert.

Hier am Institut ist ein breites Spektrum an Metabolitanalytik vorhanden. Das Spezialgebiet dieses Instituts ist die Erstellung sogenannter Metabolitenprofile. Unter diesen Profilen versteht man die gleichzeitige Erfassung möglichst vieler Stoffwechselprodukte aus einer Probe. Im folgenden nennen wir einige hier verwandte Methoden; die genaue Beschreibung der Funktionsweisen der Methoden würde den Rahmen dieser Internetseite sprengen.


  • Kapillarelektrophorese
  • Ionen Chromatographie
  • High-Performance-Liquid-Chromatographie (HPLC)
  • Gaschromatographie/Massenspektroskopie (GC/MS)
  • Matrix-assisted-laser-disorption ionisation (MALDI)
  • Ein- und zweidimensionale denaturierende und native Gele



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